微生物限度檢查法標準操作規程
一、目的：建立微生物限度檢查的基本操作規程，為微生物檢查人員提供正確的操作規程。
二、適用範圍：適用於品管化驗室的微生物限度檢查。
三、職責：品管微生物檢驗員對本標準的實施負責。
四、正文：
1定義：微生物限度檢查法：係指非規定滅菌製劑及其原輔料受到微生物汙染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。2實驗用具：
電熱恆溫培養箱、電熱恆溫水溫箱、試管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培養皿、試管架、注射器、針頭、注射器盒、研缽、75%酒精棉球、紫外燈（365nm波長）。
3培養基：
3.1營養瓊脂培養基、孟加拉紅培養基、乳糖膽鹽培養基、蛋白腖水培養基。
3.2培養基的管理、配製應符合檢定菌、培養基管理規程、培養基配製規程。
4試液：甲基紅試液、a-奈酚乙醇試液、40%氫氧化鉀溶液、靛基質試液。
5稀釋劑：0.9%無菌氯化鈉溶液。
6供試品溶液的製備：取供試品（供試品如為固體，置研缽中研磨成細粉）放入試管中，加入適量的稀釋劑製成1：10濃度的供試品溶液。
7對照用菌液：控制菌檢查均應作相應已知菌的對照試驗，對照菌株為大腸桿菌[CMCC（B）441022]。取相應菌株的營養瓊脂培養基斜面新鮮培養物1白金耳，接種至營養肉湯培養基內，培養18-20小時，稀釋至1：106，對照菌的加入量為50-100個。
8檢查法：
8.1除另有規定外，細菌的'培養溫度為30-35℃，黴菌的培養溫度為
25-28℃，控制菌的培養溫度為35±1℃。
8.2細菌、黴菌計數：
8.2.1平皿菌落計數法取均勻供試液，進一步稀釋成1：102、1：103等適宜的稀釋級。分別取連續三級10倍稀釋的供試液各1ml，置直徑約90mm的平皿中，再注入約45℃的培養基約15ml，混勻，等凝固後，倒置培養，每個稀釋級應作2~3個平皿。
營養瓊脂培養基用於細菌計數，玫瑰紅鈉瓊脂培養基用於黴菌計數。
8.2.2菌數測定陰性對照試驗取供試驗用的稀釋劑各1ml，置4個無菌平皿中，分別按細菌、黴菌計數用的培養基製備平板，培養，檢查，不得長菌。
8.2.3細菌培養時間為48小時，分別在24小時及48小時點計菌落數，一般以48小時菌落數為準，黴菌培養時間為72小時，分別在48小時及72小時點計菌落數，一般以72小時菌落數為準。菌落如蔓延生長成片，不宜計數。
8.2.4點計後，計算各稀釋級的平均菌落數，按菌數報告規則報告菌數。
8.2.5菌數報告規則：細菌宜選取平均菌落數在30-300之間的稀釋級，黴菌宜選取平均菌落數在30-100之間的稀釋級，作為報告菌數計算的依據。如只有1個稀釋級菌落數在30-300（30-100）
之間時，將該稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數報告，如同時有兩個稀釋級在30-300（30-100）之間時，按下式計算兩級比值。
比值=低稀釋級平均菌落數稀釋倍數
高稀釋級平均菌落數稀釋倍數
.當比值≤2時，以兩稀釋級的均值報告，當比值＞2時以低稀釋級平均菌落數乘以稀釋倍數報告，如同時有3個稀釋級的平均菌落數均在30-300（30-100）之間時，以後兩個稀釋級計算級間比值，如各稀釋級的平均菌落數均不在30-300（30-100）之間，以最接近30或300的稀釋級平均菌數乘以稀釋倍數報告，如各稀釋級平均菌落數均在300（100）以上，按最高稀釋級菌落數乘以稀釋倍數報告，如各
稀釋級平均菌落數均小於30時，一般按最低稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數報告，如當1：10（1：100）稀釋級平均菌落數等於或大於原液（或1：10）時，應以培養基稀釋法測定，按測定結果報告菌數。
8.2.6培養基稀釋法：取供試液（原液或1：10供試液）3份，每份各1ml，分別注入5個平皿內（每皿各0.2ml）每個平皿中傾注營養瓊脂培養基約15ml，混勻，凝固後倒置培養，計數，每1ml注入的5個平板點計的菌落數之和即為每1ml的菌落數，共得3組資料，以3份供試液菌落數的平均值乘以稀釋倍數報告。
如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數小於1時，則報告菌數為小於10個。
8.3控制菌檢查除另有規定外，取供試液10ml（相當於供試品1g、1ml、cm2），直接或處理後接種，經增菌、分離培養後，進行革蘭氏染色、生化試驗等項檢查。
8.3.1大腸菌群：
8.3.1.1檢樣稀釋及培養
①以無菌操作，將檢樣25g（ml）放於含有225ml滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適當數量的玻璃珠），經充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液後，最好在均質器中以8000—10000r/min的速度處理1min，作成1：10的均勻稀釋液。
②用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內（注意吸管尖不要接觸管內稀釋液），混合均勻，做成1：100的稀釋液。
③另取1ml滅菌吸管，按上述操作順序，做10倍遞增稀釋液。如此每次遞增稀釋一次，即換用一支1ml滅菌吸管。
④根據食品衛生標準要求或標本汙染情況的估計，選擇3個合適的稀釋度，每個稀釋度接種三管。
8.3.1.2乳糖發酵試驗
將待檢樣品接種於乳糖膽鹽發酵管內，接種量在1ml以上者，用雙
料乳糖膽鹽發酵管，
1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發酵管。每一稀釋度接種三管，置36±1℃溫箱內，培養24±2h，如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產氣者，則按下列程式進行。
8.3.1.3分離培養
將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36±1℃溫箱內，培養18~24h，然後取出，觀察菌落形態，並做革蘭氏染色和證實試驗。
8.3.1.4證實試驗
在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1~2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發酵管，置36±1℃溫箱內，培養24±2h，觀察產氣情況。凡乳糖管產氣，革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。
8.3.1.5報告：根據證實為大腸菌群陽性的管數，查MPN檢索表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。
9結果判斷：
9.1細菌菌落數、黴菌菌落數、控制菌三項均符合該品種微生物限度項下的規定，應判為供試品符合規定；其中任何一項不符合該品種項下規定，應判供試品不符合規定。
9.2細菌菌落數、黴菌菌落數第一次測定超過該品種項下微生物限度規定時，應從同一批號樣品中隨機抽樣，複試兩次，以三次結果平均值報告。
9.3如營養瓊脂培養基平板上生長黴菌菌落數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板上生長細菌菌落數超過該品種項下微生物限度規定時，經複試2次，如3次結果平均值仍超過規定，應判為供試品不符合規定。
9.4各類製劑檢出控制菌或其他致病菌時，按第一次檢出結果為準，不再抽樣複試，即應判該供試品不符合規定。
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