甲氨蝶呤/鋅鋁層狀雙氫氧化物的合成以及生物效應探究論文
1 引言
水滑石類化合物包括水滑石和類水滑石 因其主體一般由兩種金屬的氫氧化物構成, 故又稱為層狀雙金屬氫氧化物(layered double hydroxides, LDHs). LDHs的化學通式可表示為: [M2+1?xM3+x(OH)2][An?]x/n·mH2O,其中 M2+表示+2 價金屬離子, M3+表示+3 價金屬離子,A 表示層間陰離子, m 為層間水分子的摩爾數[ 1].LDHs 的層間陰離子具有可交換性, 因此, 可將各種陰離子, 如有機、無機、中性分子、酶及其他生物藥物分子等組裝到 LDHs 層間, 進而得到具有不同效能的複合材料. 此外, LDHs 獨特的層板結構能夠有地保護插入其中的分子或離子. 大量的研究證明,藥物/LDHs 奈米複合物的合成不僅可以降低藥物的毒副作用, 提高藥物的安全性、有效性, 還可提高藥物的溶解度和穩定性, 控制藥物釋放速率. 因此, 近年來, 將客體藥物組裝到 LDHs 層間製得藥物/LDHs奈米複合物的研究受到生物、醫學和材料界的廣泛關注. 北京化工大學段雪等研究了多種生物藥物插層 LDHs 層間的結構、效能以及藥物釋放的緩釋效能等. 山東大學侯萬國等選用萘普生為模型藥物分子, Zn-Al-LDHs 為載體, 合成了萘普生/LDHs, 又採用結構重組法制備了非離子型、水溶性差的抗癌藥物喜樹鹼(CPT)/LDHs。
甲氨蝶呤(MTX)是一類抗葉酸類抗腫瘤藥, 主要透過對二氫葉酸還原酶的抑制達到阻礙腫瘤細胞DNA 的合成 , 從而遏制腫瘤細胞的生長與繁殖 .MTX 是治療類風溼關節炎的主要藥物, 近年來也被用於治療系統性紅斑狼. 但 MTX 具有體內半衰期短、組織分佈廣泛、不良反應嚴重及器官靶向性差等缺點. 研究表明, MTX 組裝到 LDHs 層間形成 MTX/LDHs 奈米複合物後, 不僅能有效改善這些不足, 而且能明顯增強藥物的穩定性, 提高藥效. 目前, 製備 MTX/LDHs 的方法有共沉澱法、離子交換法、機械化學法、水熱法、成核-晶化法和焙燒還原法等.Choy 等採用共沉澱法成功合成了MTX/LDHs奈米複合材料, 並分別將 MTX 和 MTX/LDHs作用於人類骨肉瘤細胞(SaOS-2). 結果發現, MTX/LDHs 抑制腫瘤細胞生長的效率遠遠高於純 MTX, 且體內釋放半衰期延長、器官靶向性增強, 同時證明了 MTX/LDHs 在小劑量時仍具有很高的藥效, 其藥效比純MTX 高 5000 多倍。
2 實驗部分
2.1 試劑與儀器
硝酸鋅(Zn(NO3)2·6H2O, A.R., 廣東汕頭市西隴化工廠有限公司), 硝酸鋁(Al(NO3)3·9H2O, A.R., 上海新寶精細化工廠), 氫氧化鈉(NaOH, A.R., 上海國藥集團化學試劑有限公司), 氨水(NH3·H2O, A.R., 上海化學試劑有限公司), 乙醇(C2H5OH, A.R., 上海國藥集團化學試劑有限公司), 磷酸二氫鉀(KH2PO4,A.R., 上海凌峰化學試劑有限公司), 甲氨蝶呤(MTX,A.R., 浙江省湖州展望藥業有限公司 ), 二甲亞碸(DMSO, A.R., 生工生物工程股份有限公司), 小牛血清(BB001, 生工生物工程股份有限公司), DMEM 培養基(BC002, 生工生物工程股份有限公司), MTT(T0793, 生工生物工程股份有限公司 ), 胰蛋白酶(PB068, 生工生物工程股份有限公司). 實驗用水均為去離子水。
2.2 改進的共沉澱法合成 MTX/LDHs 奈米複合物
稱取 0.8924 g Zn(NO3)2·9H2O 和 0.5627gAl(NO3)3·9H2O 並溶於乙醇/水(1:3, 體積比)溶液中,配成混合鹽溶液 A; 稱取一定量的 MTX (0.2045、0.2727、0.3408 和 0.4089 g, 使得 Zn2+/Al3+/MTX 摩爾比分別為 R = 2:1:0.3、2:1:0.4、2:1:0.5 和 2:1:0.6)溶於8 mL 5%的氨水中, 配成溶液 B; 將 B 溶液轉移至三頸燒瓶中, 恆定 60℃溫度下磁力攪拌並通入 N2, 採用 pH 下降法以 0.1 mL/s 的速度滴加溶液 A, 用 25%的氨水調節混合溶液的 pH 為 8.5, 60℃下反應1 h. 最後, 用去離子水和乙醇交替離心洗滌 3 次(離心速度為 10000 r/min, 離心時間為 1 min). 合成的產物放至 50 mL 的高壓反應釜(內襯為聚四氟乙烯)中, 經100℃、24 h 的水熱處理後即製備出 MTX/LDHs 奈米複合物. 作為對比, 採用同樣方法, 不加藥物合成了Zn-Al-LDHs 母體。
2.3 緩釋效能的研究
準確稱取 0.01 g MTX/LDHs 溶解在 50 mL pH1.2 的 HCl 溶液中, 用移液管取容量瓶中 5 mL 溶液置於 50 mL 容量瓶中, 加入 45 mL HCl 定容, 所得溶液濃度約為 20 μg/mL. 用紫外-可見分光光度計在 306nm 處測定其吸光度, 並根據標準曲線計算 MTX 濃度,求出載藥量. 再根據載藥量計算緩釋實驗所需要的MTX/LDHs 奈米複合物的量, 稱取後溶解於 pH 7.4(500 mL)的磷酸鹽緩衝溶液(按照中國藥典 2005 年版第二部附錄 XIVE 方法進行配製)中, 在 37 ± 0.5℃下恆溫攪拌. 於預設定的時間間隔內, 取 3 mL 溶液高速離心分離, 取上清液用紫外-可見分光光度計在306 nm 處測量其吸光度, 根據標準曲線計算出相應的 MTX 濃度和釋放率, 並繪製出 MTX 的累積釋放曲線.
2.4 採用 MTT 法初步研究 MTX/LDHs 對肺癌A549 細胞的增殖抑制作用
人肺癌細胞株 A549 購自上海細胞庫, 用含 10%小牛血清、100 U/mL 青黴素和鏈黴素的 DMEM 培養基, 於 37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養. 將人肺癌A549 細胞接種於 100 mL 的培養瓶中, 培養基為含有10%小牛血清的 DMEM, 置於 37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養箱孵育, 細胞為貼壁生長, 用顯微鏡觀測待細胞長滿培養瓶的 70%~80%, 用 0.25%的胰蛋白酶消化, 傳代. 用 10% DMEM 稀釋細胞懸液, 並接種到 96 孔板, 每孔體積 100 μL. 正常培養 24 h 後吸走廢液, 加入不同濃度的MTX和MTX/LDHs (如20、40、60、80 和 120 μg/mL), 每組設 6 孔重複, 對照組加 100 μL DMEM (無血清). 分別培養 24 h 後棄除 96孔板中的殘藥和 DMEM, 每孔加入新鮮 DMEM (無血清) 90 μL 和 MTT 10 μL (5 mg/mL, pH 7.4 的` PBS配製), 繼續培養 4 h 後, 終止培養。
3 結果與討論
3.1 FT-IR 分析
在不同 R 值條件下合成的 MTX/Zn-Al-LDHs 奈米複合物的紅外光譜圖, 分子振動光譜常用於研究客體分子與主體層板、層間水等之間的作用力.從圖中可看出, 所有複合物紅外峰的峰型與峰位非常相似, 且與 MTX 紅外峰位置基本相同. 此外, 母體 NO3?-LDHs 的紅外光譜也標示於圖中. 可以看出,NO3?-LDHs 的紅外譜圖與複合物有明顯不同. 對於母體 LDHs, 3430 cm?1處的峰對應 LDHs 層板上和層間水分子的 OH?伸縮振動, 1637 cm?1處的峰對應層間水分子的變角振動, 而 1386 cm?1處的峰則對應NO3?的吸收振動. 對於 MTX/LDHs 複合物, 1386cm?1處的吸收峰明顯變弱, 說明 MTX 已經取代了層間大部分的 NO3, 這說明, 在反應中 NO3?與層板間強烈的靜電作用使部分 NO3?不易除去. MTX 的紅外光譜中, 1638 和 1508 cm?1處的峰分別對應 COO?的不對稱及對稱伸縮振動, 當 MTX 插層到 LDHs 層間後, 這兩個峰分別紅移至 1614 和 1450 cm?1處. 這是因為在鹼性環境中, MTX 末端的–COOH 電離為COO?, 帶負電的 MTX 陰離子與帶正電的 LDHs 發生強烈的靜電作用使得 COO?的不對稱和對稱伸縮振動峰發生了紅移. 以上結果均表明, MTX 組裝到LDHs 層間後, 二者之間的相互作用使得 MTX 吸收峰位置和強度均發生了變化。
4 結論
本文采用共沉澱法合成了不同 MTX/Zn-Al-LDHs 奈米複合物, 並考察其緩釋效能和癌細胞活性檢測. 研究結果表明, 合成粒子的粒徑會隨 R 值的增大而減小. 緩釋實驗結果表明, 4 種樣品均具有明顯的緩釋效能, 緩釋曲線平穩. 用 modified Freundlich模型和 parabolic-diffusion 模型進行了分步動力學模擬, 分析結果表明, MTX/Zn-Al-LDHs 奈米複合物最初的釋藥過程屬於表面藥物的擴散, 隨後的釋放屬於粒內擴散佔主導的多相擴散過程. 生物細胞活性實驗的研究表明, MTX/LDHs 較純的 MTX 具有更好的抑制癌細胞增殖的作用, 在一定範圍內, 其抑制作用隨著粒徑的減小而增強。
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