天然可降解生物材料在組織工程中的應用研究進展
摘要 細胞培養支架材料是組織工程學的重要研究內容之一，是實現產業化的關鍵。天然 可降解生物材料是細胞培養支架材料中的重要組成部分，目前用於細胞培養支架的天然可 降解生物材料主要有多糖類和蛋白質類。多糖類主要包括殼多糖、透明質酸；蛋白質類主要 包括膠原纖維蛋白和血纖維蛋白。
1987年，美國國家科學基金會正式提出了組 織工程一詞。其基本原理是將體外培養擴增的 功能細胞種植於一種生物相容性良好且可被機 體吸收的生物材料即細胞培養支架上，形成複合 物，然後將此複合物植入機體組織、器官病損部 位，以達到修復重建的目的。細胞培養支架 的研究一直是組織工程學的重要研究內容之一。 細胞培養支架是體外細胞獲取營養、進行氣體交 換、廢物排洩和生長代謝的場所。
作為細胞培養支架材料應具有以下特點； （1）良好的生物相容性；（2）生物可降解性，即可 被機體吸收利用或排出體外；（3）良好的表面活 性，有利於功能細胞的貼附、生長；（4）弱的抗原 性；（5）易加工性，易成型。
當前，在組織工程中開發為細胞培養支架的 生物材料主要分為兩類，即人工合成的材料和天 然生物材料。天然生物材料具有細胞訊號識別， 促進細胞的粘附、增殖和分化、良好的生物相容 性及良好的生物降解性等優點，顯示出人工合成 材料無可比擬的優勢。
用於細胞培養支架的天然生物材料主要分 為兩類：多糖類和蛋白質類，多糖類主要包
括殼 多糖、透明質酸及其衍生物等；蛋白類主要包括 膠原纖維蛋白和血纖維蛋白。
天然多糖類
殼多糖（Chitosan CS）
殼多糖是由甲殼素（β-（1-4）聚-2-乙醯氨基 -D葡聚糖）脫乙醯基而製得。競多糖可溶於稀 酸，其分子保留了甲殼素的結構骨架，有氨基和 羥基可加以化學修飾。可製成絲狀或膜狀等有 特殊功能的新材料。殼多糖具有無毒、生物相容 性良好且無抗原性等優點，其降解產物為對人體 無毒的N-乙醯氨基葡萄糖和氨基葡萄糖。所以 殼多糖是一種較好的細胞培養支架材料。
殼多糖衍生物的研究殼多糖分子問 及分子內有強烈的氫鍵相互作用，使其呈緊密的 晶態結構，所以殼多糖只能溶於酸和酸性水溶 液，其強度和韌性也明顯不足，這就限制了它作 為細胞培養支架的廣泛應用。但可透過各種化 學修飾製備有良好溶解性的殼多糖衍生物。
殼多糖透過醯基化後，改變了它的晶態結 構，改善了其溶解性，同時還使其具有許多特殊 的功能，如N-乙醯化殼多糖膜具有較高的抗張 強度、滲透性和血液相容性，且在酸鹼溶液中較 穩定，熱分解溫度較高，與生物體有較好的親和 性。這對其作為細胞培養的支架材料的應用具 有很大意義。
殼多糖可以進行硫酸酯化、羧甲基化、羥基 化等化學修飾，這為殼多糖在細胞培養支架材料 中的應用提供了更為廣闊的前景。
殼多糖作為細胞培養支架膜材料的性質 研究為更好地應用殼多糖作為細胞培養支 架材料，必須對不同分子量和脫乙醯度殼多糖的 理化指標及吸附性、降解性、安全性等進行研究， 同時還需要考慮到製備方法對上述性質的影響。
（1）分子量和脫乙醯度對殼多糖理化指標 的影響 對不同分子量和脫乙醯度殼多糖膜 的指標進行研究，發現隨著分子量的增加，膜的 抗張強度、伸長強度、吸溼性均會增加。而脫乙 醯度對膜的影響依賴於分子量。對同一分子量 而言，脫乙醯度越高，膜會更脆且不易吸溼。 這說明不同分子量、不同脫乙醯度的殼多糖具有 不同的性質。
（2）製備方法方面的研究 採用可控制 的冷凍和冷凍乾燥的方法對殼多糖溶液和凝膠 處理，製成孔狀、塊狀、試管狀和珠狀材料，並對 材料的脫水方法進行了研究。鄭化等採用 環氧氯丙烷交聯製備出殼多糖膜，透過FTIR、 XRD、和SEM等表徵其結構，並測試了其力學性 能。發現環氧氯丙烷的交聯可以提高膜的力學 效能、降低溶菌酶的降解速率，這方面的研究為 殼多糖在組織工程中作為細胞培養支架的應用 提供了基礎。
（3）殼多糖材料的生物相容性、降解性、安 全性方面的研究 採用生理鹽水浸泡，紫外線 消毒，植入小鼠股部肌肉的方法來研究對不同材 料來源的殼多糖膜的組織相容性和降解性進行 了研究。結果發現，60天后殼多糖降解40％，且 隨著分子量的減小，降解速度加快；當以蟹殼為 原料制的殼多糖時，其膜既無包膜現象，又無炎 症反應，表明其生物相容性良好。
透過急性毒性試驗、過敏反應、皮膚粘膜刺 激反應、熱源反應、溶血反應等系列生物學觀察， 發現由蝦殼中得到的殼多糖是一種安全可靠的 體內植入材料。
殼多糖在組織工程中作為細胞培養支 架的研究早在1985年，Popowicz等將殼多 糖溶解於醋酸中，蒸發水分製成一種薄且通透性 好的透明多孔膜，併成功用於細胞培養，將已經 建立的MDCK細胞系接種在殼多糖膜上，發現細 胞能在上面長成單層。這說明該種膜適合作為 細胞生長的支架。
在骨組織工程方面，Klokkevold等研究了 殼多糖對體外成骨細胞分化和骨形成的影響，結 果表明殼多糖具有促進前成骨細胞分化，加速骨 形成的作用。陳富林等透過體內實
驗和體外 實驗相結合的方法研究，發現成骨細胞可在殼多 糖膜上較好地貼附和伸展，植入體內後周圍組織 無明顯的炎症反應，未發現組織變性和壞死，並 可完全降解，證明它在骨組織工程中是較好的細 胞培養支架材料。
在皮膚組織工程方面，將製成殼多糖膜和海 綿狀的雙層結構用於皮膚組織工程中，將人再生 胚胎皮成纖維細胞接種在殼多糖海綿上，培養4 周後，發現細胞生長增殖良好，成纖維細胞透過 新生成的細胞外基質緊密貼附在海綿上，形成活 細胞-細胞外基質-殼多糖複合體。在整個過程 中，雙層殼多糖材料的形狀和大小保持不變。 這說明亮多糖材料在皮膚組織工程中是一種極 好的細胞培養支架。
在神經組織工程方面，匡勇等觀察幾丁 質和殼多糖膜對雪旺氏細胞生長的影響，用新生 的Wister鼠坐骨神經及臂叢神經的雪旺氏細胞 接種於見丁質膜和殼多糖膜上，在培養1、3、7天 後發現幾丁質和殼多糖膜與雪旺氏細胞有良好 的組織相容性，膜上生長的雪旺氏細胞佔94％， 成纖維細胞佔6％，而對照組雪旺氏細胞佔 71％，成纖維細胞佔29％，兩種膜均能抑制成纖 維細胞的生長。這說明殼多糖在神經組織工程 方面具有廣闊的前景。
在軟骨組織工程方面，採用軟磷脂、多聚賴 氨酸和PLA對殼多糖進行包埋後與軟骨細胞體 外培養，結果證明殼多糖作為組織工程中的細胞 培養支架材料具有很好生物相容性和可降解性 等一系列優點。
總之，作為一種天然的可降解的生物材料， 殼多糖具有良好的組織相容性、可降解性、弱的 免疫原性等特點，在組織工程方面具有很大的潛 力，此方面的研究已經受到了國內外的重視。
透明質酸（Hyaluronic acid，HA）
透明質酸廣泛存在於生物的結締組織中， 1934年，Meyer和Palmer從牛眼中最先分離到此 種物質，其相對分子量在10－100萬之間，水溶 液有很大粘性，在體內可控制細胞
和分子的滲透 和某些細胞的分化。由於透明質酸本身是一種 天然的細胞外基質，所以作為組織工程中細胞培 養支架具有廣闊的前景。
透明質酸的羥基可酯化，且能以醛和小蛋白 及乙烯碸交聯，所生成的交聯網路凝膠可作成不 同形狀和大小的製品。透明質酸為非抗原性，不 會引起炎症和異體反應。但存在時間和力學性 能有限的問題。
在軟骨組織工程中，透明質酸分子透過軟骨 細胞上的膜受體CD44錨在軟骨細胞上，軟骨 細胞合成的蛋白聚糖單體，透過與細胞外透明質 酸作用，形成親水性的大分子。Lindenhayn等 研究發現，在藻酸鹽珠中加入適量的透明質酸， 能有效地促進軟骨細胞的擴增，因為透明質酸是 軟骨細胞基質的主要成分之一，在軟骨生長和基 質形成中起到重要的作用。
Stark等對一種含有鐳射微孔的透明質酸 膜（LaserskinR）進行了研究，結果發現這種薄膜在 體外對細胞無毒性，可以有效地作為底物支援表 皮細胞的生長。在特定的培養條件下，保持旺盛 的增殖潛能，待達到亞匯合時，可以直接移植到 創面上。所以透明質酸在皮膚組織工程中具有 廣闊的前景。
但由於透明質酸的溶解性和不易貼附的特 點，也限制了它在組織工程中作為細胞培養支架 材料的應用。但對透明質酸進行了交聯，再用聚 賴氨酸包被，在其上培養雪旺氏細胞，發現聚賴 氨酸包被後，雪旺氏細胞的貼附率為350－ 400cells／mm2，未包被的為0－10cells／mm2，這說明 對透明質酸進行交聯和表面修飾後，可以作為神 經組織工程中細胞培養的支架材料。
蛋白類
膠原蛋白纖維（Collagenous Fiber）
膠原蛋白纖維是動物細胞合成的一種生物 性高分子，廣泛存在於動物骨、腱、軟骨和
皮膚及 其它結締組織中，約佔哺乳動物總蛋白的1／3， 是重要的動物細胞外基質成分，可為表皮細胞遷 移、增殖鋪墊支架，並提供良好的營養，有利於上 皮細胞的生長。故而它在組織工程中應用較多。
膠原支架的安全性透過毒性、無菌程度、溶 血性、致熱源性的檢測以及在兩種動物模型中膠 原Ⅰ的免疫原性檢驗，證明是一種可移植的安全 且能夠支援軟骨細胞生長的基質材料。 在骨組織工程中，Ⅰ膠原蛋白纖維透過成骨 細胞表面的特異性受體β整合素Ⅱ與成骨細胞 緊密結合。Mizuno等將Ⅰ型膠原用作骨髓基 質細胞的培養基質，發現骨髓基質細胞可定向分 化為成骨細胞，最終形成含骨髓成分的新生骨組 織，並且在此過程中無軟骨生成。
膠原蛋白在軟骨組織工程中的應用較廣泛。 研究證實，採用膠原支架作為模板能夠支援軟骨 細胞的生長及合成基質，生產出大體上組織學和 生物特徵都與犬半月板相似的軟骨。
Orwin等在膠原纖維組成的0.1mm孔的. 膠原海綿上培養人的角膜上皮細胞、內皮細胞和 角質形成細胞，並對上皮和內皮細胞進行組織學 和掃描電鏡觀察。結果表明，角膜上皮和內皮細 胞可以在膠原海綿上擴充套件並有正常的表型，上皮 細胞可受內皮細胞產生的可溶性因子的影響。 這表明膠原可以作為角膜細胞培養的支架材料。
在皮膚組織工程中Horch等用Ⅰ型膠原 膜作為支架培養人的角質形成細胞去重建表皮， 在沒有滋養層細胞和無血清的條件下將角質細 胞植入牛的Ⅰ型膠原膜上，待培養到一定條件後 植入裸鼠傷口處，結果表明，未交聯的牛Ⅰ型膠 原膜上的角質細胞可以誘導多層鱗片上皮細胞 的重建，有助於傷口的癒合。
血纖維蛋白（Fibrin）
血纖維蛋白凝膠是纖維蛋白單體聚合成，它 具有可塑、可粘附和可降解的特性。這種
生物來 源的天然生物材料可以作為組織工程中細胞培 養的支架材料。纖維蛋白單體在聚合成凝膠時 會釋放出血小板來源的生長因子和β轉化因子， 促進細胞增殖和基質分泌，這種聚合物包埋分離 的軟骨細胞，可為軟骨細胞提供空間支援。
Sims等利用纖維蛋白單體在凝血酶作用 下形成凝膠的天然過程製成纖維蛋白凝膠，然後 包理軟骨細胞作為軟骨細胞生長的基質材料。 植入無胸腺小鼠皮下，12周後新生軟骨組織為 透明軟骨，且比較接近正常軟骨。
此種新型材料在機械強度、降解時間、材料 來源等方面還存在一些問題，這方面的研究正在 深入進行。
天然共混材料作為細胞培養支架研究
體內細胞生長的基質非常複雜，且不同的細 胞生長基質也不同，所以在組織工程中，不同類 型細胞對其培養支架材料的效能要求不同，單一 材料較難適應細胞培養的要求，透過共混調整不 同材料之間的比例，使共混材料具有更適合細胞 培養的力學效能、降解性等性質。天然可降解生 物材料既可以與天然的生物材料共混，也可以與 人工合成的生物材料共混。
共混膜材料性質的研究
對膠原-愨多糖共混膜的超微結構，力學性 能等方面進行的研究表明，共混膜的效能比單純 殼多糖膜的效能要好，且可以透過改變交聯條件 如PH、時間和濃度來改變膜的一些性質，這為共 混膜在組織工程中的應用提供了基礎。
餘家會等採用溶液共混的方法制備了殼 多糖-明膠共混膜，並採用FTIR、XRD、SEM等方 法對該膜的透光率、吸水率和力學效能進行了測 試，結果表明，殼多糖與明膠之間有強的相互作 用和良好的相容性，殼多糖的加入有利於改善明 膠的力學效能。
共混膜材料在組織工程中作為細胞培養支 架的應用研究
天然可降解材料與人工合成材料之間的 共混用聚乙烯醇PVA／殼多糖混合膜體外培 養成纖維細胞，並以掃描電鏡觀察，發現PVA／殼 多糖在成膜過程中其表面及內部空間發生很多 變化。以DSC分析發現PVA和殼多糖這兩種多 聚物之間相容性不太好；而用ESCA分析發現其 膜表面富集了很多氮原子，這些都反映了PVA 膜經殼多糖修飾，可影響混合膜的生物相容性。 以混合膜培養成纖維細胞，用掃描電鏡進行形態 學分析，並以MTT法計數，發現PVA／殼多糖混合 膜比單純PVA膜更適於細胞生長，且培養於 PVA／殼多糖混合膜的細胞與單純PVA膜細胞相 比，能更好地擴散，更平整，更緊湊。這些結果都 表明PVA/殼多糖混合膜可以促進細胞貼附和生 長，PVA／殼多糖混合膜將是一種很有前途的細胞 培養生物材料。
天然可降解生物材料之間的共混美 國Integra生命科學公司開發的IntegraTM人工皮膚 已被美國食品及醫藥管理局（FDA）批准，它的皮 層由交聯的Ⅰ膠原纖維與硫痠軟骨素的多孔網 格組成，此網格起生物降解的膜板的作用。可以 引起皮層組織結構再生，膠原-硫痠軟骨素還可 由戊二醛的交聯來調節其降解速度，臨床實驗確 認了IntegraTM人工皮膚的顯效性，且在1995年獲 準進入市場。
EIcin等將殼多糖與膠原、明膠或白蛋白 混合制膜，以增強膜的生物親和性和表面粗糙程 度，再在膜上接種大鼠和胎豬的肝細胞，透過兩 周的培養，發現混合膜適合於肝細胞的貼附和生 長，這說明該材料可為細胞生長和形成擬肝細胞 提供適當支援。
Tan等對膠原--殼多糖複合細胞外基 質在組織工程中的應用進行了研究，對膠原-殼 多糖細胞外基質對細胞的形態、分化和功能進行 了實驗，結果表明，隨著亮多糖比例的增加，複合 基質的完整性提高，掃描電鏡顯示殼多糖的新增 將會大大地影響複合基質的超微結構，改變膠原 纖維的連線方式。K562細胞培養實驗結果顯 示，雖然隨著亮多糖比例的
提高，細胞的增殖受 到抑制，但是以細胞因子釋放為基礎的細胞功能 卻有很大的提高。這說明膠原-殼多糖材料作為 細胞培養的支架具有十分大的潛力。
Sechriest等用殼多糖和硫痠軟骨素A混 合製得水凝膠，在其中接種上牛的關節軟骨細 胞，發現細胞能很好地貼附於材料上，並且細胞 能保持一些軟骨細胞特殊的表型，如細胞呈圓 形，有有限的有絲分裂，能生成Ⅱ型膠原及蛋白 聚糖等，這些結果證實硫痠軟骨素A-殼多糖可 能是一種很好的自體軟骨移植載體材料或用於 組織工程中類軟骨組織的骨架。
展望
天然高分子材料來源於生物體本身，具有組 織相容性較好，毒性較小，易降解且降解產物易 被人體吸收而不產生炎症反應等優點，所以在組 織工程中作為細胞培養的支架材料具有人工合 成材料所不可比擬的優勢，同時天然生物材料也 存在一些需要解決的問題：
（1）天然可降解的生物材料每批產品的質量 都不一樣，故其產品質量比較難控制，這不利於 研究工作的深入。天然高分子材料在力學效能 及降解速度、通透性等方面存在矛盾，即高分子 量通常有高強度，但是它的降解速度和通透性就 難以滿足組織工程中細胞培養支架的要求。因 此，統一材料的質量標準，嚴格控制其質量，加強 材料的性質等基礎理論的研究十分必要。
（2）共混生物材料的研究開發，可以取長補 短，來滿足組織工程中不同組織的要求，但生產 出具有合適降解速度、良好通透性、弱免疫原性 的細胞培養支架材料。還需加強對共混膜的性 質及製備方法的研究。
（3）對現有天然生物材料，包括其衍生物也 有待於進一步的研究開發，如對殼多糖和透明質 酸進行化學修飾，產生多種衍生物，使其更適合 作為細胞培養的支架材料。
（4）天然可降解生物材料與細胞之間的粘附 問題也有待於進一步的研究，選擇有利於細胞粘 附的材料，同時可以對作為細胞培養支架的材料 進行表面修飾，如可將骨形成蛋白（BMP）與殼多 糖／PLA混合，然後再作為成骨細胞培養的支架， 結果表明此支架材料可以大大提高成骨細胞的 分化速度。
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